• Parentele biologiche: Il DNA non mente

    L'accertamento della paternità si basa sul confronto tra genitore e figlio di alcuni marcatori trasmessi geneticamente. Dalla fine degli anni novanta, il materiale utilizzato è il DNA, ma la storia di questi test ha visto protagonisti di volta in volta diversi marcatori ereditari. Il test del DNA consiste nell'esame della struttura di particolari regioni dei cromosomi dotate di una variabilità individuale tanto alta da acquisire in ognuno un assetto del tutto tipico che, per analogia con le impronte digitali, è stato chiamato DNA fingerprint.


    La prima applicazione pratica di questo test in ambito giudiziario avvenne nel 1985 in Gran Bretagna; da allora sono stati individuati loci genetici sempre più discriminativi (minisatelliti e microsatelliti) e metodi analitici più specifici. Fondamentale è stata la scoperta della reazione a catena della DNA-polimerasi (PCR) da parte di Kary B. Mullis, con cui è possibile amplificare anche piccole quantità di materiale genetico.

    I campioni di DNA ottenuti con la PCR vengono oggi analizzati con il sistema del confronto delle bande elettroforetiche, che ha consentito di superare gli ostacoli propri delle tecniche precedenti, come l'impiego di sostanze radioattive, i lunghi tempi di attesa e le possibili difficoltà interpretative. Inoltre, il grande numero di marcatori utilizzati e la loro distribuzione su diversi loci cromosomici garantiscono l'affidabilità del risultato, evitando quegli errori che possono derivare da mutazioni o delezioni cromosomiche; infatti, mentre i primi esami di paternità si basavano sull'esame di 4 o 5 sequenze al massimo, oggi è normale analizzarne da 10 a 15. Attualmente, la diffusione di kit di analisi che vagliano gruppi precostituiti di marcatori senza richiedere apparecchiature sofisticate ha consentito a molti laboratori di offrire gli accertamenti di parentela tra le loro prestazioni. Tuttavia, l'attendibilità dei risultati è ancora molto legata alla competenza del personale e all'affidabilità degli strumenti, per cui l'esame resta molto costoso (due-tre milioni di lire) ed è effettuabile soltanto in regime privato.


    Le applicazioni

    Le applicazioni principali dell'esame del DNA sono due: l'identificazione personale da residui biologici e il riconoscimento del rapporto parentale. L'identificazione personale assume rilievo soprattutto in ambito penale poiché permette di individuare l'autore di un delitto a partire da residui organici, anche minimi: l'esame può essere fatto su qualsiasi materiale che abbia una componente cellulare da cui estrarre il DNA, quindi sangue, sperma, bulbi piliferi, saliva, sudore. Il materiale genetico tende a degradarsi con diversa velocità a seconda delle condizioni ambientali (umidità, temperatura, inquinamento batterico, eccetera). Può durare poche ore o pochi giorni nei casi più sfavorevoli, ma se ben conservato può essere analizzato anche a distanza di anni: una volta congelato si preserva indefinitamente; a temperatura ambiente, un campione asciutto (per esempio una goccia di sangue raccolta su una carta assorbente) si conserva più a lungo che in forma liquida. Si intuisce perciò come in certi casi (per esempio dopo uno stupro) sia essenziale il tempestivo prelievo delle tracce biologiche eventualmente presenti.

    L'accertamento parentale sta diventando quasi di routine poiché le leggi attuali conferiscono ai figli naturali gli stessi diritti ereditari e di mantenimento dei figli legittimi. Secondo l'iter giudiziario l'esame ematologico è una tappa pressoché obbligata, che la prassi divide in due parti: il disconoscimento, cioè l'accertamento che il padre ufficiale non è quello biologico, e il riconoscimento, cioè l'identificazione del vero genitore. L'esame richiede pochi millilitri di sangue raccolto in provette trattate con anticoagulante. Nel caso di bimbi molto piccoli è addirittura sufficiente prelevare qualche goccia di sangue su carta assorbente oppure una piccola quantità di saliva con un tampone sterile. Le indagini sulla paternità possono comunque essere richieste anche in via privata, come valutazione preliminare a una causa in tribunale.


    Le possibilità di errore

    Le analisi basate sulla tipizzazione del DNA sono ormai molto attendibili, tuttavia non possono essere considerate esenti da inesattezze. Oltre a errori umani (scambio di campioni, cattiva conservazione dei reperti) esiste una serie di fattori interferenti di cui occorre sempre tener conto: n è possibile che la PCR non rilevi certi alleli (i cosiddetti silenti); questo fenomeno si verifica soprattutto nell'analisi di alleli che hanno un peso molecolare molto diverso tra loro: quello più pesante può sfuggire all'amplificazione.

    I sistemi allelici che danno tale fenomeno sono, però, ben noti, per cui l'operatore esperto può attuare opportune verifiche con altri metodi n possono verificarsi mutazioni; è stato osservato che ricorrono nei microsatelliti con una frequenza media abbastanza alta (1 ogni 1.000-10.000 meiosi). Quindi, se uno o due marcatori risultano incompatibili è lecito sospettare che la non corrispondenza sia dovuta a una mutazione.

    In questi casi la conferma della paternità biologica può derivare dal controllo di un numero adeguato di altri marcatori. Qualora si riscontri un'unica incompatibilità, essa viene considerata un fattore di semplice diminuzione della probabilità piuttosto che di esclusione certa. Ciascun figlio presenta, per ogni locus genetico esaminato, due alleli, dei quali uno di provenienza materna e uno di provenienza paterna (per i casi di non disponibilità del genotipo materno vedi il riquadro qui a fianco). Dato che sull'identità della madre esistono di rado discussioni, nell'esame vengono dapprima scorporati gli alleli di provenienza materna e analizzata la compatibilità degli alleli rimasti con quelli di origine paterna.

    La presenza nel figlio di polimorfismi genetici incompatibili (per la legge di Mendel) con quelli del presunto padre può far rigettare la parentela con sostanziale certezza, fatto salvo per le poche possibilità di errore dovute agli inconvenienti descritti prima. Qualora tutti i marcatori risultino compatibili o si verifichi una falsa incompatibilità dovuta ai fattori interferenti citati, occorre dare un peso statistico al risultato. Sono stati studiati e raccolti in banche dati gli indici statistici che indicano la diffusione dei polimorfismi genetici nella popolazione generale su cui si fondano calcoli piuttosto complessi. Nella pratica si utilizza il cosiddetto indice di paternità, cioè un valore di probabilità che viene espresso generalmente in percentuale: più alto è il numero di marcatori risultati compatibili, più alta sarà tale probabilità.


    L'interpretazione dei risultati

    Poiché il calcolo statistico esprime un'approssimazione all'infinito, non si ottiene mai una probabilità del 100 per cento, e questo margine residuo di incertezza può essere fonte di frustrazione per gli interessati. Occorre tener presente però che, quando supera un certo valore, l'indice di probabilità equivale praticamente a una certezza; il criterio applicato è analogo a quello usato per le impronte digitali, e deriva dalla considerazione che la probabilità contraria è talmente bassa da non potersi ipotizzare una coincidenza (fanno eccezione casi particolarissimi di popolazioni ristrette e con pool genetico molto condiviso).

    In Italia non esiste una norma precisa che stabilisce la soglia oltre la quale una probabilità di paternità sia da considerare equivalente a una certezza: si fa riferimento in genere alle legislazioni di altri paesi europei come la Germania, che ha stabilito un limite del 99,72 per cento, o i Paesi Bassi che, con atteggiamento più restrittivo, pretendono il 99,90 per cento. Oggi, comunque, grazie alle tecniche avanzate e all'alta capacità discriminativa degli alleli esaminati, non è infrequente raggiungere probabilità anche più alte del 99,99 per cento. Come si è scritto, perché l'accertamento sia attendibile, l'esame deve essere eseguito da persone esperte e deve essere utilizza strumentazione affidabile.


    Conclusioni

    Se il medico di famiglia viene consultato in merito e ritiene opportuno l'indagine, è importante che raccomandi ai suoi pazienti centri dotati di una solida competenza, che sappiano valutare l'esistenza di alleli silenti o mutazioni. In genere questi laboratori sono ubicati presso università, grandi ospedali o strutture private di alto livello. A causa dei costi, solo in pochi possono servirsi di particolari apparecchi, come il sequenziatore, che facilitano le indagini minimizzando il rischio di errore interpretativo. Il referto, inoltre, non deve contenere un responso sintetico di paternità o non paternità, ma riportare la costellazione di marcatori esaminati e la percentuale di probabilità calcolata.


    I padri di oggi sono più certi

    La storia dei test di paternità iniziò negli anni venti con gli unici marcatori allora conosciuti, quelli del sistema ABO; successivamente le conoscenze si estesero al sistema MNSs e, negli anni quaranta, al sistema Rh, rendendo disponibili altri marcatori eritrocitari, che però, esprimendosi solo a livello fenotipico, avevano tutti una capacità discriminativa modesta e offrivano risultati spesso ambigui e di difficile interpretazione. Scoperto nel 1958, venne poi introdotto il sistema HLA, legato agli antigeni leucocitari e dotato di maggiore specificità, ma dopo trent'anni si è arrivati all'esame diretto del DNA che, con le tecniche odierne, è affidabile al 100 per cento o quasi.


    Quando la madre si defila

    L'esecuzione dell'esame richiederebbe il consenso e il coinvolgimento di tutte le parti interessate, ma non è infrequente che qualcuno, spesso la madre, si rifiuti di fornire il proprio sangue e l'accertamento venga effettuato su due soli individui. In assenza della madre, si procede infatti al confronto diretto tra padre e figlio; ciò impone l'esame di un numero molto elevato di marcatori, ma i risultati sono spesso del tutto soddisfacenti sia in termini di riconoscimento che di disconoscimento. Un altro sistema per superare l'ostacolo del dissenso da parte di un componente della famiglia consiste nel ricostruirne il genotipo attraverso l'esame di suoi consanguinei eventualmente disponibili.